介绍和表达PIK3CA^E545K在乳头状甲状腺癌中BRAF^V600E细胞系导致去分化的侵袭型

间变性甲状腺癌(ATC)是一种罕见的、侵袭性的未分化甲状腺癌，其进展迅速，几乎是致命的。至少有一部分ATC被认为是由预先存在的分化良好的甲状腺癌引起的，最常见的是乳头状甲状腺癌(PTC)。而PIK3CA突变在PTC中很少见，但在ATC中很常见，并倾向于与BRAF突变。这为我们的研究提供了理论基础，以确定的潜在作用PIK3CA从高分化甲状腺癌到未分化甲状腺癌发展过程中的突变。我们介绍了PIK3CA^E545K进入LAM1 PTC细胞系，该细胞系携带aBRAF^V600E突变。在培养中，工程细胞系(LAM1:PIK3CA^E545K)增殖速度更快，并表现出相对于携带空载体的亲本系增加的克隆潜能(LAM1^电动汽车)．都是LAM1^电动汽车和LAM1:PIK3CA^E545K将编辑过的细胞株植入无胸腺裸鼠后侧翼，在体内测定疾病进展。而LAM1的肿瘤重量和体积并没有显著增加:PIK3CA^E545K小鼠甲状腺分化标志物TTF-1、甲状腺球蛋白、PAX8和B-catenin的表达降低，提示引入PIK3CA^E545K导致体内去分化。总的来说，这项研究提供了一个作用的证据PIK3CA^E545K推动疾病从高分化甲状腺癌发展为未分化甲状腺癌;然而，过表达并不是ATC加速生长表型的决定因素。

图形抽象

甲状腺癌分化良好的亚型(乳头状甲状腺癌，PTC;滤泡性甲状腺癌;FTC)预后良好，通常5年生存率超过95% [1］．相比之下，间变性甲状腺癌(ATC)是一种罕见的未分化甲状腺癌，进展迅速，死亡率超过90% [2，3.］．手术、放疗和化疗对于ATC通常是无效的，患者在诊断后的中位生存期约为6个月，一些患者在诊断后几天内死亡[4，5，6，7］．因此，ATC是最致命的人类恶性肿瘤之一。

PTC的基因改变频率较低，大多数肿瘤携带单一驱动突变，且没有肿瘤抑制基因改变[8］．相比之下，ATC的突变情况更为复杂，许多肿瘤除肿瘤抑制因子外，还携带多种癌基因突变[9］．目前的一种甲状腺癌模型表明，ATC源于先前存在的高分化甲状腺癌(WDTC)，这是在额外的遗传事件积累之后，产生了一种更具侵袭性的癌症[2］．事实上，高达79%的ATC患者同时存在WDTC或既往有WDTC病史(最常见的是PTC)，这进一步证明了其源于既往存在的甲状腺癌病变[10］．一种特殊的ATC肿瘤同时携带这两种物质BRAF^V600E和PIK3CA典型热点突变，以E545K变异最为常见[9］．而BRAF^V600E突变在PTC和ATC肿瘤中均有很高的频率(分别为59.7%和45%)PIK3CA仅在0.5%的PTC患者样本中存在，而在ATC中出现的频率要高得多，为18% [8，9］．作为BRAF而且PIK3CA突变倾向于在ATC肿瘤中同时发生，我们假设a的引入PIK3CA突变成BRAF突变PTC模型会导致侵袭性增加和细胞去分化，模拟了从PTC到ATC的可能进展路线。

细胞系和培养条件

LAM1细胞系，来自约翰·科普兰医生(梅奥诊所，杰克逊维尔，佛罗里达州)的礼物BRAF^V600EPTC细胞系，用于本研究[11］．LAM1细胞系在添加10%胎牛血清(GIBCO)、青霉素(100µg/mL)和链霉素(100µg/mL) (Invitrogen)的DMEM/F12培养基中培养。短串联重复序列(STR)分析在高级基因组学中心进行，如前所述[12］．PCI6A和JHU029都是头颈部鳞状细胞癌细胞系，都携带典型的热点突变PIK3CA．PCI6A携带E545K突变，JHU029携带H1047L突变。本研究以PCI6A作为E545K突变表达的阳性对照，以JHU029验证突变引物qPCR的特异性。

转染PIK3CA^E545K将表达载体导入LAM1细胞系

最常见的PIK3CAATC中出现的变异为E545K变异[9]，为我们的研究提供了理论基础。PIK3CA外显子9 E545K是Bert Vogelstein的礼物(Addgene质粒#16,642)。这个表达式向量[13]转染LAM1亲本细胞年代(PTC(列车自动控制系统)BRAF^V600E)以产生一个稳定的PIK3CA^E545K用于过表达研究的突变体。该突变细胞系记为LAM1:PIK3CA^E545K．使用空的载体控制质粒(记为LAM1)进行平行转染^电动汽车)．用Lipofectamine 3000试剂(Cat no. 3000)转染亲本细胞系。L3000001，赛默飞世尔科学公司)根据标准方案使用5µg质粒DNA。细胞孵育过夜，第二天用正常细胞系培养基替换转染培养基。次日加入300µg/mL浓度的geneticin (G418)进行筛选，对未转染的细胞进行筛选。使用的G418浓度是预先确定的LAM1细胞系使用标准杀伤曲线。

免疫印迹

如前所述，每孔加载20µg蛋白完成免疫印迹(Pinto等．2018)。PI3激酶(p110α)(猫号;4249)和α-微管蛋白(猫号;2125)抗体从Cell Signaling Technology公司获得。膜用过氧化物酶偶联抗兔二抗1:5000稀释室温孵育1小时。使用Luminata Forte Western HRP底物(EMD Millipore)进行靶蛋白检测。α-微管蛋白作为负载对照。

增长曲线

细胞以每孔2400个细胞的密度播种到96孔板中。然后在0、24、48和72小时使用PrestoBlue(赛默飞世尔科学公司)读取板。荧光读数使用BioTek Synergy Microplate Reader完成，激发波长为560 nm，发射波长为590 nm。一个未配对的学生，两条尾巴t-test用于统计分析，LAM1之间进行比较^电动汽车和LAM1: PIK3CA^E545K每个时间点的细胞系。P< 0.05为差异有统计学意义。将72 h时间点与对照组在同一时间点进行统计分析。

剂量-反应曲线(依托泊苷)

依托泊苷是临床上用于治疗ATC的化疗药物，其作用机制是抑制拓扑异构酶II。将细胞系以每孔2400个细胞的密度播种到96孔板中，在37°C和5% CO下孵育过夜₂．24 h后，用依托泊苷(Cat no E1383;Sigma Aldrich)使用浓度范围为0.125至32 μ M。72小时后，用PrestoBlue在37°C下培养细胞1小时，读取培养皿。在PrestoBlue孵育后，荧光读数使用BioTek Synergy Microplate Reader完成，激发波长为560 nm，发射波长为590 nm。为了生成剂量-反应曲线，将原始荧光数据加载到Prism®8 GraphPad Software中，然后将值归一化为未处理的对照样品，并计算每种测试浓度的平均生存力。为了确定半最大抑制浓度(IC₅₀)，依托泊苷处理样品的归一化相对荧光单位(RFU)计算为未处理样品的平均RFU的百分比。然后将药物浓度转换为对数刻度(Log₁₀)及集成电路₅₀数值计算采用非线性回归(曲线拟合)(Prism8)。

单独分析

LAM1^电动汽车和LAM1:PIK3CA^E545K将细胞以每孔1000个细胞的密度播种到6孔组织培养板中。以亲代细胞的集落形成为基础，在37°C下培养细胞10天，每3天更换一次细胞培养基。用PBS清洗细胞，用100%冷冻甲醇固定15分钟。固定后，用0.5%结晶紫在10%甲醇/1 × PBS中染色10分钟。使用Brightfield显微镜定量集落形成，集落定义为≥50个细胞。为了量化，每个孔中有三个代表性的场被用来计算菌落的数量，这对亲本和突变细胞系都是完成的。LAM1:PIK3CA^E545K将细胞与亲代对照系进行比较p< 0.05为菌落形成差异有统计学意义(Student 's t检验)。

克隆测定:辐射反应

林^电动汽车和LAM1:PIK3CA^E545K细胞以每孔250 (0 Gy)、500 (1 Gy)、1000 (2 Gy)和2000 (4 Gy)细胞的密度在6孔板中接种，24小时后分别施加不同剂量的辐射(三次生物重复)。细胞在37°C下孵育一周，每三天更换一次细胞培养基。PBS清洗细胞，100%冷冻甲醇固定15分钟。固定后，细胞用0.5%结晶紫在10%甲醇/1 × PBS中染色10分钟。用明场显微镜定量计数染色菌落，菌落≥50个。计算了未经处理的细胞的电镀效率(PE)。计算生存分数，定义为放射治疗后产生的菌落数量，并以PE [14］．

细胞迁移试验

LAM1细胞迁移^电动汽车和LAM1:PIK3CA^E545K使用24孔细胞迁移板和荧光分析对细胞系进行定量。cba - 100;Cell Biolabs Inc)。将初始细胞悬液以5 × 10的密度放置在含有无血清培养基的上腔中⁴每个细胞室，3个生物重复。细胞在37°C下孵育，以允许迁移细胞通过聚碳酸酯膜并附着在腔室底部。留在上腔的细胞被认为是非迁移的。然后使用细胞迁移板试剂盒中提供的细胞分离缓冲液将迁移细胞从腔室的膜上分离。用同一试剂盒中提供的CyQuant GR荧光染料裂解并定量转染细胞。荧光读数使用BioTek Synergy Microplate Reader完成，并使用明场显微镜收集代表性图像。

后侧模型研究甲状腺癌疾病进展

小鼠按照西部大学AUP 2015-045协议进行维护和处理。我们使用LAM1细胞系^电动汽车和LAM1:PIK3CA^E545K用于建立异种移植后侧翼疾病模型(n=每组5名)。在小鼠模型中使用前用plasmoin处理细胞株两周，并在使用前筛查支原体。实验开始前，将两种细胞系在添加10%热灭活FBS的DMEM/F12培养基中培养两周。共1 × 10⁶将细胞皮下注射到每只无胸腺裸鼠的后侧。每周对小鼠称重两次，当使用数字卡尺触摸到肿瘤时，每周测量一次肿瘤尺寸(长度和宽度)。单个肿瘤体积计算公式:[长×(宽)²] × 0.52 [15］．注射后14周处死小鼠。肿瘤解剖，重量以毫克(mg)为单位记录(附加文件)2:表S2)并保存在福尔马林中用于FFPE块制备和IHC研究。

免疫组织化学

在分子病理学核心设施(Western University)进行免疫组化(IHC)染色，切4µM切片，检测甲状腺相关标志物的表达。根据制造商的说明使用一抗:TTF-1 (Abcam;ab76013)， PAX8 (Abcam;ab76013)， β连环蛋白(细胞信号;8480S)， Ki67(细胞信号;9027S)和甲状腺球蛋白(安捷伦;IR50961-2)。使用Aperio ScanScope切片扫描仪扫描切片。

统计分析

一个学生的不配对的，两条尾巴t-测试使用Prism®8 Graphpad Software Macintosh版本(by Software MacKiev©1994-2014 Graphpad Software, Inc)。P值< 0.05为有统计学意义。P值被定义为不重要p> 0.05， *表示p< 0.05， **表示p< 0.01， ***表示p< 0.001， ****表示p< 0.0001。

转染PIK3CA^E545K进入LAM1细胞促进细胞增殖、集落形成和细胞迁移

为了研究甲状腺癌从良好分化到未分化的细胞状态的进展，我们从人类PTC细胞系LAM1开始，它含有BRAF^V600E在相当一部分ATCs中发现突变[16］．转染LAM1细胞稳定表达PIK3CA^E545K，这在航空管制中心也很常见[9］．免疫印迹法证实PIK3CALAM1中的蛋白质:PIK3CA^E545，但不是LAM1^电动汽车(无花果。1A). RT-PCR证实了特异性PIK3CA的表达^E545K突变变异体与野生型PIK3CA在改变的细胞(附加文件1:图S1)。LAM1图像^电动汽车和LAM1:PIK3CA^E545K电镀24 h后，用亮场显微镜收集细胞株。细胞表现出比LAM1更少的细长形态^电动汽车但总体细胞形态仍然相似(图2)。1B).此外，LAM1在48和72 h时细胞增殖显著增加:PIK3CA^E545K与对照LAM1相比^电动汽车使用归一化相对荧光单元(RFU)的细胞(p< 0.0001)(图1C)。

接下来，我们测量了表达激活的影响PIK3CA克隆潜能突变。LAM1:PIK3CA^E545K与LAM1相比，两周后形成的菌落数量显著增加^电动汽车对照细胞(11.00±1.00 vs. 7.33±0.58;p= 0.005)(图2A).我们还研究了细胞迁移是如何受到PIK3CA^E545K利用transwell系统和荧光分析，发现细胞稳定表达PIK3CA^E545K与对照细胞株相比，它们的迁移能力显著增加(p= 0.004)(图2B)综合这些数据表明，加上PIK3CA^E545K对LAM1 PTC细胞系增加细胞增殖和促进集落形成和细胞迁移，体外。

的表达PIK3CA^E545K没有改变细胞系对依托泊苷或辐射的敏感性

相对于分化良好的甲状腺癌亚型，ATC通常对常规治疗无反应[17，18］．因此，我们选择研究LAM1之间药物反应的潜在变化^电动汽车和LAM1:PIK3CA^E545K确定细胞是否添加PIK3CA^E545K到BRAF^V600E背景导致对临床使用的治疗方案有更多的耐药性。我们首先用依托泊苷治疗细胞，它在临床上用于治疗ATC。我们发现LAM1的反应没有显著差异^电动汽车和LAM1:PIK3CA^E545K细胞系(LAM1^电动汽车集成电路₅₀0.99µM vs LAM1:PIK3CA^E545K集成电路₅₀1.02µM,p> 0.05;无花果。3.A).由于ATC相对于PTC具有抗辐射性，我们接下来确定激活PIK3CA对辐射敏感性的影响[4，17］．我们用1戈瑞，2戈瑞和4戈瑞照射细胞株。在大多数辐射剂量下，LAM1之间的辐射敏感性没有差异^电动汽车和LAM1:PIK3CA^E545K除2戈瑞外(p= 0.02，图3.B).总的来说，这些数据表明，对传统疗法(包括化疗药物依托泊苷和放疗)的总体反应，似乎没有随着药物的引入而发生显著变化PIK3CA^E545K在一个BRAF^V600E体外检测PTC细胞系。

引入PIK3CA^E545K导致体内分化良好的甲状腺癌标志物的丢失

使用LAM1生成小鼠后侧翼模型^电动汽车和LAM1:PIK3CA^E545K以确定肿瘤生长、体积和转移能力是否会有任何差异。在两组中，在我们14周的研究期间，5只小鼠中有2只没有出现可检测到的肿瘤(附加文件)2:表S2)。双侧LAM解剖肿瘤的代表性图像^电动汽车和LAM1:PIK3CA^E545K组被生成(图;4A，刻度单位为毫米;毫米)。LAM1:PIK3CA^E545K在肿瘤体积最大的小鼠1-L组，小鼠左上方也有一个肿大的腋窝淋巴结(图1-L组)。4A).这只老鼠也被发现有最大的肿瘤体积。尽管LAM1的平均肿瘤重量和肿瘤体积较高:PIK3CA^E545K与对照异种移植相比，这些差异没有统计学意义(图2)。4B)。

然后，我们利用免疫组化来确定与甲状腺细胞去分化一致的细胞标记物的表达是否存在差异。Ki67染色在LAM1中更强:PIK3CA^E545K提示异种移植物细胞增殖增加(图;4C,D)．分化良好的甲状腺癌几乎普遍表达甲状腺转录因子-1 (TTF-1)、PAX8、甲状腺球蛋白和b -连环蛋白;然而，这些蛋白的表达缺失往往是ATC的特征[17］．而父母LAM^电动汽车表达这四种标记的细胞株，编辑LAM1:PIK3CA^E545K细胞中所有四种标志物的表达水平都显著降低，这表明肿瘤表达激活了PIK3CA分化程度较低(图;4C,D)．

目前的证据表明，ATC肿瘤的一个子集是由WDTC通过额外突变的积累而产生的[2，19］．而BRAFWDTC和ATC的突变都很常见，PIK3CA突变最常发生于ATC，与BRAF提示两条通路同时激活是ATC发生的一条途径。为了验证这一假设，我们稳定地引入了PIK3CA激活突变BRAF-突变PTC系，并评估了体外和体内对许多癌症相关表型的影响。激活PIK3CA导致体外增殖、克隆潜能和迁移增加，但不改变体外对依赖泊苷或辐射的敏感性。在体内，表达的细胞被激活PIK3CA没有形成比对照模型生长更快的肿瘤;然而，他们证明了分化良好的甲状腺细胞的标记物的丢失，这表明激活的PIK3CA的引入有助于细胞去分化。LAM1和修饰LAM1的生长^电动汽车是出乎意料的，因为生成该亲本LAM1细胞系的作者报告说，细胞系异种移植在裸鼠中不会植入或产生肿瘤[11］．STRs证实我们的LAM1细胞与原始亲本系相同，遗传漂变不能解释这种差异，但可能指出小鼠品系来源或设施之间的固有差异。

总的来说，这些发现表明激活PIK3CA对WDTC向ATC的进展至少有一部分贡献。的确,PIK3CA与WDTC相比，ATC只是几个被发现更频繁突变的基因之一。许多其他基因改变在未分化甲状腺癌中过度代表，包括突变TP53，CDKN2A，叔，EIF1AX；然而，下一代测序研究发现的许多变异可能是乘客突变，而不是癌症驱动因素[20.，21］．事实上，也有人报道KRAS和PTEN共突变是促使分化的甲状腺滤泡细胞进入未分化状态所必需的[22］．但这并没有得到大多数深度测序研究的支持，这些研究清楚地显示了BRAF和PIK3CA突变的共同发生，并表明NRAS和PTEN在未分化水平上是排他的(不会同时发生)遗传变化[9，23］．因此，对这些其他基因进行类似的功能验证是必要的，以确定这些变化的上下文依赖性。同样重要的，可能是突变的时间顺序。去分化可能是获得进一步突变的先决条件，这些突变可能影响增殖、耐药或转移。

迄今为止，ATC的特征仅通过目标测序或小外显子组和拷贝数阵列研究[9，10，23，24，25］．为了全面了解其背后的基因变化，需要进行更大规模、多平台的分析。建立这种罕见但致命疾病的序列、拷贝数、结构/表观遗传和表达格局，可以进一步帮助我们提高对WDTC向ATC进展的理解，并可以为验证提供其他变体的鉴定。当然，ATC的罕见性意味着策划大量高质量的样本是一个重大障碍。为了促进这些重要的研究，大型合作小组的努力是必要的。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

不适用。

这项研究由加拿大卫生研究所(CIHR)资助ACN和PCB 377832加元。PCB由CIHR和Terry Fox研究新研究者奖以及NIH/NCI资助，奖金编号为P30CA016042。ACN得到了沃尔夫头颈部癌症生物学研究教授基金的支持。

作者及隶属关系

1. 加拿大安大略省伦敦市西部大学耳鼻咽喉头颈外科开云体育国际

   Nicole Pinto, Kara M. Ruicci, Mohammed Imran Khan, Mushfiq Hassan Shaikh, Yu Fan Peter Zeng, John Yoo, Kevin Fung, S. Danielle MacNeil, Adrian Mendez, John W. Barrett和Anthony C. Nichols

2. 加拿大西部大学解剖与细胞生物学系，伦敦，ON

   妮可·平托

3. 加拿大西部大学肿瘤学系，伦敦

   John Yoo, Kevin Fung, S. Danielle MacNeil, Adrian Mendez, Joe S. Mymryk和Anthony C. Nichols

4. 伦敦地区癌症计划，劳森健康研究所，伦敦，ON，加拿大

   John Yoo, Kevin Fung, S. Danielle MacNeil, Adrian Mendez, Joe S. Mymryk和Anthony C. Nichols

5. 加拿大西部大学微生物与免疫学系，伦敦

   Joe S. Mymryk

6. Eli和edybroad再生医学和干细胞研究中心，加州大学洛杉矶分校，美国

   保罗·c·布特罗斯

7. 美国加州大学洛杉矶分校精准健康研究所

   保罗·c·布特罗斯

8. 美国加州大学洛杉矶分校Jonsson综合癌症中心

   保罗·c·布特罗斯

9. 伦敦健康科学中心，800专员路E, STN B，伦敦，ON, N6A 5W9信箱5010号，加拿大

   安东尼·c·尼科尔斯

贡献

概念化:NP, ACN;实验:NP, JWB;编辑修订:NP、KMR、MIK、MHS、YFPZ、JY、KF、SDM、AM、JSM、JWB、PCB、ACN;监督:JSM, JWB, ACN。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到安东尼·c·尼科尔斯．

伦理批准并同意参与

小鼠按照西方大学动物使用协议Nichols 2015-045进行维护和处理。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

所有作者(NP, KMR, MIK, MHS, YFPZ, JY, KF, SDM, AM, JSM, JWB, PCB, ACN)没有任何冲突或竞争利益需要披露。

出版商的注意

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